近年来, 城市生活污水呈现出低碳氮比的趋势, 给污水处理厂的正常运行和达标排放带来一系列的问题.如, 大量外碳源的投加和高的回流比造成去除单位污染物的能耗高, 低有机负荷和低溶解氧条件下污泥的膨胀以及脱氮效率差等问题.鉴于此, 本研究提出了一种新型的混凝沉淀/后置固相反硝化滤池工艺(CS-BAF-SPDB)用于低碳源污水的脱氮处理.该工艺的优点在于:强化了一级生化处理(CS), 既缓解了进水SS对后续生物滤池单元的堵塞问题, 同时也缓解了进水中过高的有机物浓度对硝化滤池中硝化作用的抑制(前期研究发现BAF的*适C :N比为3 :1);采用硝化滤池(BAF)强化低碳源污水的硝化作用, 既可以保证生物量, 又可以避免污泥丝状菌膨胀.固相反硝化滤池(SPDB)采用固体碳源代替传统的填料和液体碳源, 从根本上解决了反硝化对进水碳源的依赖, 可以避免液体碳源在有氧条件下的无效消耗, 连续稳定地为生物反硝化提供有机碳源, 同时也可以避免液体碳源投加过量导致的运行成本高和出水有机物易超标等问题.并且, 前期的研究表明固体碳源具有很高的机械强度和非常长的使用寿命(质量损失为0.05% ·d-1), 可使反硝化滤池保持长期稳定的反硝化效果.

　　气水比是影响BAF-SPDB工艺脱氮效率的一个关键因素.气水比太小, 则BAF中的硝化不完全, 不仅出水氨氮超标, 同时无法为后续的反硝化提供稳定的硝酸盐; 气水比太大, 一方面会造成能耗过高, 同时BAF出水中过高的溶解氧浓度也会对固相反硝化滤池中的缺氧环境造成一定的破坏, 进而对反硝化造成影响.因此, 确定合适的气水比是保证该工艺获得理想脱氮效果的关键.

　　本课题组前期研究了工艺的启动情况及进水C/N比、HRT、温度和进水氨氮负荷对工艺脱氮效果的影响.在此基础上, 本文重点研究了气水比对该工艺脱氮效果的影响, 并采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术研究了微生物群落结构随气水比的变化规律, 以期为工艺优化与反应机制的研究提供分子生态学依据.

　　1 材料与方法1.1 试验材料

　　聚己内酯(PCL)和黏土陶粒分别由深圳光华伟业实业有限公司和江西萍乡三河陶瓷有限公司提供, 两种填料的理化性质如表 1所示.

　　表 1 黏土陶粒和聚己内酯的理化性质

 　　1.2 试验装置

　　CS-BAF-SPDB主要由混凝沉淀池, 硝化滤池和固相反硝化滤池组成, 滤池主体采用有机玻璃制作, 其结构如图 1所示.其中混凝池和沉淀池的体积均为10 L; 曝气生物滤池的滤柱高度为175 cm, 内径为8 cm, 滤柱内填充的滤料为黏土陶粒, 填充高度为87 cm, 从承托层顶部到填料顶部共设4个取样口(B1、B2、B3和B4);固相反硝化滤池的滤柱高度为130 cm, 内径为8 cm, 滤柱内填充的滤料为聚己内酯颗粒, 填充的高度为27 cm, 从承托层顶部到填料顶部共设3个取样口(D1、D2和D3).曝气生物滤池和固相反硝化滤池的有效体积(液体体积)分别为4.0 L和3.2 L.工艺进水流量通过蠕动泵(BT-1002J)控制.曝气生物滤池由空压机供气, 进气量通过气体流量计和阀门控制.温度控制仪严格控制进水水温和滤池内的温度.

　　图 1

 

图 1 试验装置示意

　　1.3 反应器运行与取样方法

　　前期的研究成功实现了CS-BAF-SPDB的启动, 并确定了BAF进水中的合适C/N比, BAF和SPBD的理想HRT和运行的适宜温度.为研究低碳源条件下气水比对CS-BAF-SPDB工艺脱氮效果的影响.保持进水氨氮浓度为30 mg ·L-1, 混凝沉淀单元出水中的C/N控制在3 :1, 温度维持在(28℃ ±1℃), BAF和SPDB的水力停留时间分别为4 h和2 h, 使得BAF的气水比在6 :1(进气量100 mL ·min-1)到1 :1(进气量16.7 mL ·min-1)的范围内变化.当连续3 d出水的NO3--N浓度相对误差在5%之内, 认为系统在该气水比条件下已趋于稳定, 可以改变气水比到另一水平.另外, 前期的研究已经确定, BAF中的硝化菌主要集中在B3取样口, 而SPDB中的反硝化菌主要集中在D2取样口.因此, B3和D2取得生物膜样品更具有代表性.当系统在各气水比条件下稳定运行时, 从B3和D2取样点取生长有生物膜的陶粒和固体碳源填料, 利用超声波将填料上的生物膜剥离, 去掉填料, 离心后弃掉上清液, 沉淀物即生物膜样品, -20℃保存.

　　1.4 DNA的提取和PCR扩增

　　采用FastDNATMSPIN Kit For Soil提取样品基因组DNA.以样品基因组DNA为模板, 采用细菌通用引物GC-338F和518R扩增样品16S rDNA高变区序列. PCR扩增体系(50 μL)为: 10×PCR buffer 5 μL; dNTP(2.5 mmol ·L-1)3.2 μL; rTaq(5 U ·μL-1)0.4 μL; GC-338F(20 mmol ·L-1)1 μL; 518R(20 mmol ·L-1)1 μL; 模板DNA 50 ng; 补ddH2O至50 μL.

　　PCR扩增程序为: 94℃预变性5 min; 94℃变性1 min, 55℃复性45 s, 72℃延伸1 min, 30个循环; *终72℃延伸10 min. PCR产物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit纯化回收.

　　PCR仪为Biometra公司生产的T-gradient, 凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统.

　　1.5 PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析

　　取10 μL PCR的产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析.采用变性梯度为35%~55%、浓度为7%的聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓冲液中150V 60℃下电泳5 h.

　　变性梯度凝胶电泳(DGGE)完毕后、采用银染法染色、步骤如下:固定液(乙醇50 mL、冰醋酸2.5 mL、定容500 mL)固定15 min; Milli-Q纯水清洗、20 s和2 min各一次; 银染液(硝酸银1 g、37%甲醛0.75 mL、定容500 mL)染色15 min; Milli-Q纯水清洗、20 s和2 min各一次; 显色液(氢氧化钠7.5 g、37%甲醛2.5 mL、定容500 mL)显色5~7 min; *后用终止液(乙醇50 mL、冰醋酸2.5 mL、定容500 mL)终止反应.染色结束后在Gel-Doc2000(Bio-Rad, USA)凝胶成像系统上拍照.

　　1.6 DGGE图谱中优势条带的回收与测序

　　用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带, 采用OMEGA公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的条带.

　　以2 μL回收产物为模板, 338F/518R为引物进行PCR扩增. PCR扩增体系(50 μL)为: 10×PCR buffer 5 μL; dNTP(2.5 mmol ·L-1)3.2 μL; rTaq(5 U ·μL-1)0.4 μL; 338F(20 mmol ·L-1)1 μL; 518R(20 mmol ·L-1)1 μL; 模板DNA 1 μL; 补ddH2O至50 μL. PCR扩增程序为: 94℃预变性4 min; 94℃变性30 s, 55℃复性30 s, 72℃延伸30 s, 30个循环; *后, 72℃延伸10 min.

　　将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后, 连接到Pmd18-T载体上, 并转化至DH5α感受态细胞中, 筛选阳性克隆, 菌液采用测序仪(ABI 3730, 美国)对插入的细菌16S rDNA片段进行序列测定.

　　1.7 数据分析

　　测序结果采用DNAstar和Cluster软件进行序列分析, 下载*相似的菌株序列作为系统发育树的参考序列.然后采用MEGA软件, Neighbor-joining法构建系统发育树, 自展数(bootstrap)为1000.

　　2 结果与讨论2.1 气水比对后置固相反硝化滤池工艺脱氮性能的影响

　　图 2所示为气水比对CS-BAF-SPDB工艺硝化, 反硝化及TN去除的影响.从图 2(a)可以看到, 当气水比从6 :1降低到4 :1时, 气水比的变化对硝化作用的影响很小.虽然BAF出水中硝态氮的浓度随气水比的变化波动较大, 但是当硝化效果在每个气水比条件下达到稳定时, BAF出水中硝态氮浓度在气水比变化前后的差别很小.但是, 随着气水比的进一步的降低, BAF中的硝化作用受到了明显的抑制. BAF出水中的硝态氮浓度从气水比为4 :1时的21.78 mg ·L-1迅速下降到气水比为3 :1时的13.15 mg ·L-1, 并逐渐降低到气水比为1 :1时的9.08 mg ·L-1.氨氮去除率随气水比的降低可能与BAF中硝化菌的生物活性降低有关.据Li等的报道, 当气水比从2 :1增加到3 :1时, 硝化菌的生物活性(以O2计)上升了3.8 mg ·(mg ·h)-1.从图 2(b)可以看出, 当气水比从3 :1降低到2 :1时, 由于硝化效果的恶化, BAF出水中氨氮浓度出现了明显的上升.同时, BAF出水中氨氮的浓度和SPDB出水中氨氮的浓度非常接近, 说明SPDB对氨氮几乎没有去除效果.

　　图 2

 

(a)硝态氮; (b)氨氮; (c)亚硝态氮; (d)总氮图 2 气水比对CS-BAF-SPDB工艺硝化、反硝化以及TN去除的影响

　　气水比的变化对反硝化造成的影响比较明显.如图 2(a)所示, 当气水比从6 :1降低到4 :1时, BAF出水中的平均硝态氮浓度几乎未发生变化(22.5~22.1 mg ·L-1), 而SPDB出水中的硝态氮浓度则从5 mg ·L-1降低到1 mg ·L-1, 表明在高气水比条件下反硝化过程受到了一定的抑制.如前面所述, PCL通过生物降解释放出的有机碳源可以消耗BAF出水中携带进入SPDB的溶解氧以维持反硝化所需的缺氧环境.但是, PCL在生物降解作用下释放出的有机碳源的量是有限的.在气水比较高的情况下, BAF出水中携带的溶解氧浓度也高(7.2 mg ·L-1).当BAF出水携带进入SPDB的溶解氧的浓度超过PCL释放出的有机物所能消耗的溶解氧时, 残留的溶解氧(3.0 mg ·L-1)将破坏缺氧的环境, 进而使得反硝化不能顺利地进行.从图 2(a)也可以看出, 在气水比从4 :1降低到1 :1的过程中, SPDB出水中的硝态氮浓度几乎没发生变化, 且一直维持在非常低的水平.

　　总之, 当气水比低于4 :1时, 气水比的变化对反硝化几乎没有影响, 但是对硝化具有非常明显的抑制作用; 当气水比高于4 :1时, 气水比的变化对硝化几乎没有影响, 但是对反硝化影响较大.此外, CS-BAF-SPDB工艺对TN的去除率也是先上升后下降, 并且在气水比为4 :1时达到*佳, 从图 2(d)可以看出, 此时TN的去除率为91.6%.因此, 为同时实现*佳的硝化和反硝化效果, 混凝沉淀/后置固相反硝化滤池工艺中硝化滤池的气水比应该设定为4 :1.

　　2.2 DGGE图谱分析

　　图 3(a)所示为不同气水比条件下硝化滤池生物膜样品的DGGE图谱及量化分析.从中可以看出, 随着气水比的降低, 泳道上的条带数量出现了明显的减少(从气水比为6 :1时的31减少到气水比为2 :1时的10).这说明, 硝化滤池中相当一部分的微生物为好氧菌, 且其对溶解氧有较高的要求, 在低溶解氧条件下无法生存而逐渐被淘汰, 进而导致硝化滤池中微生物的多样性在不断下降.例如, 条带1、2、3、4和6等只出现在气水比为6 :1的条件下, 而在其他气水比条件下却没有发现.条带8、9和10在各个泳道中都有出现, 说明这些条带代表的微生物具有很强的适应性和较宽的生态幅.但是, 条带8和10在气水比为2 :1时条带信号亮度出现了明显的降低, 说明条带8和10代表的微生物的数量在低溶解氧条件下出现了明显的降低.此外, 有些微生物群落只在特定的情况下才出现, 如条带7和12代表的微生物只有在气水比为4 :1的条件下才出现, 并成为优势菌落.具体联系污水宝或参见http://www.dowater.com更多相关技术文档。

　　图 3

 

图 3 不同气水比条件下生物膜样品的DGGE条带及量化分析

　　图 3(b)所示为不同气水比条件下固相反硝化滤池生物膜样品的DGGE图谱及量化分析.从中可以看到, 气水比的变化对微生物的多样性有一定的影响, 但是影响程度较小, 各泳道上的条带数(从气水比为6 :1时的21减少到气水比为2 :1时的15)变化较小.说明气水比的变化对固相反硝化滤池微生物多样性的影响程度要低于硝化滤池.条带1、3、8、13和15各个泳道中都有出现且浓度较高, 说明这些条带代表的微生物都是优势菌群, 且具有很强的适应性和较宽的生态幅.此外, 当气水比降低到2 :1时, 这些条带的信号亮度出现了明显的上升, 说明低溶解氧的环境有利于这些微生物的生长, 使得这些微生物的生长速率增加, 数量上升.条带2、11、12和14所代表的菌群随着气水比的降低逐渐在固相反硝化滤池中成为优势菌群, 表明这类菌群是缺氧或厌氧微生物, 可以通过控制气水比使这些菌群富集.此外, 有些微生物菌落只在特定的条件下才会出现.如条带5和9代表的菌落只在气水比为6 :1时出现, 而条带7只有在气水比为4 :1时才出现.

　　2.3 特征条带回收测序和系统发育分析

　　变化明显的优势条带经过切胶回收、扩增、再回收、纯化、克隆转化后进行序列的测定, 并对测序结果进行Blast比较鉴定, 寻找与序列相似性*高的已知分类地位的菌株, 结果见表 2和表 3.对上述条带采用MEGA软件, Neighbor-joining法构建系统发育树, 结果如图 4和5所示.

 

　　表 2 硝化滤池DGGE凝胶条带回收序列分析结果

 

　　表 3 固相反硝化滤池DGGE凝胶条带回收序列分析结果

　　图 4

 

图 4 基于16S rDNA序列的硝化滤池生物膜中主要菌落的系统发育树

　　图 5

 

图 5 基于16S rDNA序列的固相反硝化滤池生物膜中主要菌落的系统发育树

　　从表 2和图 4可以看出, 条带8和10对应的菌株分别与Nitrosomonas sp. Nm47和Candidatus Nitrospira defluvii*相似. Nitrosomonas sp. Nm47和Candidatus Nitrospira defluvii分别是废水生物处理系统中重要的氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌.因此, Nitrosomonas sp. Nm47和Candidatus Nitrospira defluvii是硝化滤池中主要的硝化细菌.当气水比从6 :1降低到4 :1后, 代表这两种微生物菌属的条带没有发生明显的变化, 说明气水比在一定范围内的降低不会对硝化细菌的组成和数量造成显著的影响.相应地, 当气水比从6 :1降低到4 :1后, 硝化滤池硝化效果变化不大, 始终保持较高的氨氮去除率(图 2).但是当气水比从4 :1进一步降低到2 :1后, 代表这两种微生物菌属的条带信号亮度出现了明显的降低, 说明氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌的数量出现了明显的下降.相应地, 当气水比从4 :1降低到2 :1后, 硝化作用受到明显的抑制, 氨氮去除率明显下降(图 2).造成这种现象的原因可能在于, 硝化滤池在低溶解氧条件下, 缺氧环境可能在生物膜中形成, 使得硝化细菌的生长和活性受到一定程度的影响.综上所述, 气水比降低后导致的氨氧化菌和硝酸盐氧化菌数量及活性的下降是导致硝化效果恶化的直接原因.条带9和12对应的菌株与Acinetobacter calcoaceticus和Acinetobacter sp.的相似性均达到了100%. Acinetobacter calcoaceticus与Acinetobacter sp.是生物膜中比较常见的异养硝化菌, 可以利用进水中的有机物进行硝化作用.在气水比为6 :1时, 这两种微生物的数量较低, 而当气水比降低到4 :1后, 这两种微生物逐渐发展成为优势菌.气水比的降低减少了异养好氧菌对有机物的消耗, 使得有机物浓度有所上升, 有利于异养硝化菌的生长, 同时异养硝化菌的硝化过程几乎不受溶解氧浓度的影响.当气水比从6 :1降低到4 :1的过程中, 虽然硝化细菌的数量和活性未发生明显的变化, 但是气水比的降低会影响溶解氧在生物膜中的传递速率, 然而硝化效果并未受到明显影响, 说明异养硝化菌这类优势菌的形成弥补了溶解氧对硝化的影响.条带7和11对应的菌株分别与Pseudomonas sp.和Enterobacter aerogenes*接近. 其中前者为厌氧发酵过程中常见的厌氧产氢菌, 而后者为典型的兼性厌氧菌.这两种菌落的富集也进一步证实了气水比的降低对溶解氧在生物膜中的传递产生了不利的影响.

　　表 3和图 5所示分别为固相反硝化滤池DGGE凝胶条带回收序列分析结果及主要菌落的系统发育树.从中可以看出, 条带1、3、8和13对应的菌株分别为Dechloromonas agitata、Myxobacterium AT3-03、Comamonas granuli和Rubrivivax gelatinosus. Ginige等的研究表明, Dechloromonas是以甲醇作为碳源驯化的活性污泥中的主要反硝化菌. Manucharova等的研究发现, Myxobacteria可以以固体碳源(草生灰化石)作为**碳源进行反硝化, 并且该菌株在草生灰化石中是*活跃的反硝化菌, 表现出*强的反硝化活性. Comamonas granuli菌株属于丛毛单胞菌科, 具有将硝态氮还原成亚硝态氮的能力; Rubrivivax gelatinosus可以将亚硝态氮还原为氮气, 但是不能以硝态氮作为电子受体.上述条带对应的反硝化菌群是固相反硝化滤池中的优势菌群, 且在3个气水比条件下的泳道中都存在, 表明气水比的变化对固相反硝化滤池中的优势菌反硝化菌的影响较小.当气水比降低到2 :1时, 上述条带代表的微生物的数量出现了较明显的增加, 说明在低气水比条件下, 硝化滤池中出水携带进入固相反硝化滤池的溶解氧浓度低, 在固相反硝化滤池中营造了良好的缺氧环境, 有利于反硝化菌的生长和繁殖.条带5与菌株Nitrosomonas sp. Nm47*接近.从前面的分析已知, Nitrosomonas sp. Nm47是典型的氨氧化菌.该菌在固相反硝化滤池生物膜中的出现, 表明表层生物膜存在一定浓度的溶解氧.造成这种情况的原因可能在于, 在气水比较高的情况下, 硝化滤池未被完全利用的溶解氧随出水进入到固相反硝化滤池中, 而反硝化滤池底部固相碳源材料在微生物降解作用下释放的有机碳源在好氧微生物的呼吸作用下消耗的溶解氧有限, 部分未被消耗的溶解氧进入滤池中部填料表面的生物膜.当气水比降低到4 :1, 条带5消失了, 说明硝化滤池出水中的溶解氧浓度较低, 且在固相反硝化滤池底部就被消耗掉了, 可以保持较好的缺氧环境.对比不同气水比条件下固相反硝化滤池的反硝化效果的研究(图 2)结果也证实了这一点.当气水比为6 :1时, 固相反硝化滤池出水的硝态氮浓度波动较大, 表明反硝化受到硝化滤池出水中溶解氧的影响.但是, 当气水比为4 :1时, 出水中的硝态氮则一直维持在较低的水平.条带4对应的菌株为Pseudomonas sp..付晓的研究发现Pseudomonas sp.可以通过分泌PCL解聚酶将PCL分解为PCL单体和二聚体, 而据Honda等的研究发现, 反硝化菌可直接利用PCL的单体和二聚体作为电子供体进行反硝化.此外, Pseudomonas sp.还是一种好氧反硝化菌, 在有溶解氧存在的条件下可以利用氧气作为电子受体进行反硝化作用.条带12、14和15对应的菌株分别是Acinetobacter sp.、Bacillus sp.和Thiobacillus aquaesulis, 这些菌株均属于好氧反硝化菌. Acinetobacter sp.受气水比的影响较小, 而Bacillus sp.和Thiobacillus aquaesulis则随着气水比的降低逐渐成为优势菌株.说明气水比的降低有利于固相反硝化滤池中好氧反硝化菌的富集.

　　3 结论

　　(1) BAF-SPDB工艺中BAF的*佳气水比为4 :1.在该气水比条件下, BAF和SPDB针对低碳源污水可同时获得理想的硝化和反硝化效果, 并且BAF-SPDB工艺对TN的去除率可达到91.6%.

　　(2) 宏观运行参数对BAF和SPDB处理效果的影响和微观微生物群落的动态变化直接相关.在BAF中, 氨氧化菌(Candidatus Nitrospira defluvii)和亚硝酸盐氧化菌(Nitrosomonas sp. Nm47)的组成, 数量与活性随气水比的变化直接决定了BAF中硝化效果的好坏, 而SPDB中固体碳源降解反硝化微生物Pseudomonas sp.、Myxobacterium AT3-03和异养反硝化菌Dechloromonas agitate, Comamonas granuli和Rubrivivax gelatinosus的群落结构随气水比的变化直接决定了SPDB中有机碳源的释放和反硝化效能的优劣.同时, Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter sp.、Bacillus sp.和Thiobacillus aquaesulis等异养硝化和好氧反硝化菌也在系统中发挥重要作用.(来源：环境科学 作者：张千)